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工业品久效磷的急性毒性与遗传毒性试验ames试验实验报告

来源:未知作者:admin 更新时间:2019-11-18 12:52
预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 毒理实验报告 预防医学 2006 级 余治平 90606126 2010 年 8 月 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 一、工业品久效磷的急性毒性与遗传毒性试验 久效磷,英文通用名称为 monocrotophos,学名 O,O-二甲基-2-甲基氨

  预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 毒理实验报告 预防医学 2006 级 余治平 90606126 2010 年 8 月 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 一、工业品久效磷的急性毒性与遗传毒性试验 久效磷,英文通用名称为 monocrotophos,学名 O,O-二甲基-2-甲基氨基甲酰基-1-甲基 乙烯基磷酸酯,分子式为 C7H14NO5P,分子量为 223.16。对光较稳定,但热稳定性较差。 对钢和铁有腐蚀性。纯品为无色结晶,熔点为 54~55℃。工业品为红棕色稠状液体,熔点 为 25~30℃。沸点(0.399Pa)120~125℃,相对密度(20℃)1.33,折射率 n 25 D 1.4783; 蒸气压(20℃)9.33×10 -4Pa、 30℃)1.867×10 -4 Pa。在正辛醇中的溶解度为 z5 % 、 ( 甲苯中为 6%,稍溶于,微溶于四氯化碳,不溶于石油醚,正己烷中溶解度为 0.05% 。 可溶于水、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙二醇和苯等。在酸性、中性介质中较稳定。是一种高 效内吸性有机磷杀虫剂,具有很强的触杀和胃毒作用。作用机制为抑制昆虫体内的乙酰胆碱 酯酶。资料显示雄性大鼠、雌性大鼠经口 LD5017mg/kg、20mg/kg。大鼠经皮 LD50 为 122mg/kg;兔经皮 LD50 为 354~709mg/kg。对鸟高毒,鹌鹑急性经口 LC50 约 0.1mg/ L(7d) 。两年饲喂试验表明,大鼠无作用剂量为每天 lmg/kg,狗为每天 1.6mg/kg。对 兔皮肤和眼睛有轻微刺激作用。 第一部分 40% 工业品(40%)久效磷的急性毒性试验 工业品(40%)久效磷的急性毒性试验 本部分实验包括霍恩氏法(horn’s)和简化寇氏法两部分,将受试物(40%工业品久效 磷)以不同剂量经口给予试验动物,以实验动物死亡作为观测终点,依据剂量 -反应关系, 经过统计学方法处理求得受试物的致死剂量, 并计算出引起实验动物群体半数动物死亡的剂 量,即(LD 50) 。 ? 霍恩氏法(horn’s) 一、实验动物:健康的成年 ICR 小鼠,体重 18~26g,由北京大学医学部毒理学系实验室于 实验前准备。自由摄食饮水。 二、试剂与器材: 40%工业品久效磷、 苦味酸酒精饱和溶液、 蒸馏水、 一次性注射器 (1.0ml)、 吸量管(1ml、2ml、5ml) 、容量瓶( 25ml、50ml) 、烧 杯 (10ml、50ml) 、吸管、小鼠 灌胃针头、动物称、洗耳球、滤纸。 三、实验方法: 1.实验动物的分组:采用配伍组设计法,即将小鼠按体重从小到大排序,将16 只小鼠编成 4 个配伍组,即 1-4 号为第一配伍组,5-8 号为第二配伍组,以此类推。由随机数码表,随机 指定 4 行,每行只取随机数字 1-4,其余舍去,依次标记于各配伍组的小鼠编号下,每只小 鼠号下面的随机数字即为该小鼠应分入的实验组。详见表 1-1-1.1 和表 1-1-1.2。 表 1-1-1.1 霍恩氏法小鼠随机区分结果 ♂体 重 (g) 19.2 20.6 21.0 21.1 23.6 22.3 22.6 24.1 编号 2 4 8 3 5 6 7 1 随机数 1 2 4 3 1 4 3 2 ♀体 重 (g) 18.9 20.1 20.4 20.5 20.9 21.8 21.9 20.1 编号 19 79 89 69 39 59 29 49 随机数 3 2 4 1 3 2 1 4 1 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 组别 A B C D 2 1 3 6 表 1-1-1.2 霍恩氏法小鼠随机区分结果 动物编号 5 4 7 8 69 79 19 89 29 59 39 49 2.实验动物的处理:利用组距为 2.15 的剂量系列进行试验,选择剂量为 2.15、4.64、10.00、 21.50mg/kg 体重作为受试剂量。受试物浓度(mg/ml,c)由单位体重给药剂量(mg/kg, d)和 单位体重给药体积( ml/kg,v)决定,即 c=d/v。组 A→组 D 给药浓度分别为 0.215、0.464、 1.00、2.15mg/ml。溶液配制:0.5ml 原液稀释至 50ml 后,分别取 0.538、1.16、2.50、5.38ml 再稀释至 10ml 即可按照 0.1ml/10g 灌胃。 四、实验结果及分析 观察小鼠反应,于 24 小时后记录各组小鼠死亡情况,详细结果见表 1-1.1.3。 表 1-1-1.3 霍恩氏法实验结果 灌药 剂量 A 组 B 组 C 组 D 组 组别 (mg/kg 体重) 2.15 4.64 10 21.5 雄鼠 编号 2 5 1 4 3 7 6 8 体重(g) 19.2 22.9 24.1 20.6 21.1 22.6 22.3 21.0 编号 69 29 79 59 19 39 89 49 雌鼠 体重(g) 20.5 21.9 20.1 21.8 18.9 20.9 20.4 22.3 死亡 只数 0 0 1 4 实验动物出现活动迟缓、管状尾、抽搐、瘫痪、流涎、肌肉震颤等毒性反应,但多数未 达到致死效果。根据小鼠死亡情况查《毒理学实习指导》14页表,发现无此结果对应的LD50 值。进一步分析发现除D组动物全部死亡之外,其余各组动物死亡率均不高,只有C组有一只 动物死亡, 可能由于本实验观察期限不足或者实验员灌胃不够熟练或者其他实验操作过程不 够规范所致。 小结 利用霍恩氏(horn’s)法用来进行对受试物的 LD50 的测定以及估算 LD0 和 LD100,具有较 为经济简便,耗费较少的小鼠,并且结果计算较为简单等优点。但由于实验过程较为简单以 及结果计算是通过查表获得等原因,本实验有实验结果不够精确,以及有可能出现查表无法 得到具体 LD50 值等缺点。本实验由于时间限制仅限课堂观察,而不是按照急性毒性实验需 要两周观察期限的标注进行, 因此造成假阴性结果的可能性较大。 另外实验员都是本科学生 , 其实验操作水平等可能不能到达标准要求,也可能造成实验结果的偏差。 ? 简化寇氏法 一、 实验动物:健康的成年 ICR 小鼠,体重 18~26g,雌雄各半,由北京大学医学部毒理学 系实验室于实验前准备。自由摄食饮水。 二、试剂与器材: 40%工业品久效磷、 苦味酸酒精饱和溶液、 蒸馏水、 一次性注射器(1.0ml)、 2 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 吸量管(1ml、2ml、5ml) 、容量瓶( 25ml、50ml) 、烧 杯 (10ml、50ml) 、吸管、小鼠灌胃 针头、动物称、洗耳球、滤纸。 三、实验方法: 1.实验动物的分组:采用配伍组设计法,分组结果详见表 1-1.2。 2.实验动物的处理:利用霍恩氏法得出的大致 LD0 、LD 100 及剂量组数 n=5,求出正式实验各 剂量组间的组距,即 i 值。i=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)=(lg21.5-lg4.64)/(5-1)=0.1665。选择剂量 为 4.64、6.81、10.00、14.66、21.50mg/kg 体重作为受试剂量。组 A→组 E 给药浓度分别为 0.464、0.681、1.000、1.466、2.150mg/ml。溶液配制:0.5ml 原液稀释至 50ml 后,分别取 1.16、1.70、2.50、3.67、5.38ml 再稀释至 10ml 即可按照 0.1ml/10g 灌胃。 四、实验结果及分析 观察小鼠反应,于 24 小时后记录各组小鼠死亡情况,详细结果见表 1-1-2。 表 1-1-2 简化寇氏法各剂量组小鼠灌药剂量、编号、体重及死亡情况 灌药 剂量 组 别 (mg/kg 体重) 21.5 雄鼠 编号 23 14 9 2 8 6 19 17 18 13 1 12 7 25 16 4 15 5 24 3 体重(g) 23.7 21.8 21.6 21.0 22.6 22.4 21.4 20.4 23.2 21.6 21.3 20.7 23.4 21.8 21.1 20.8 23.8 22.1 21.0 21.0 编号 7 25 12 17 24 6 8 23 3 5 9 19 14 4 15 2 18 1 16 13 雌鼠 体重 23.8 23.3 22.5 22.0 23.8 23.3 22.6 22.2 23.3 23.2 22.6 22.2 23.5 23.2 22.6 20.7 23.3 23.2 22.2 21.7 死亡 只数 A 组 8 B 组 14.66 8 C 组 10.00 5 D 组 6.82 2 E 组 4.64 0 实验动物出现活动迟缓、管状尾、抽搐、瘫痪、流涎、肌肉震颤等毒性反应。 按照下述公式计算受试物(久效磷)的 LD50。 lgLD 50=Xm?i(Σ p-0.5) Xm:最大剂量的对数值 i:相邻两剂量比值的对数 Σp:各剂量组动物死亡率总和 Slg LD 50=i√∑piqi/n pi:各组动物死亡率 qi=1-pi n:各组动物数 LD 50 的 95%可信限区间: lg ?1(lg LD50±1.96Slg LD 50) 3 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 代入 数 据 得 lgLD50=lg21.5-0.1665*(2.875-0.5)=0.937 。 SlgLD50=0.1665* =0.048, 所以 LD50=8.65mg/kg 体重,95%置信区间为(7.00,10.74) 。 根据简化寇氏法结果,参照《毒理学教程》 (周宗灿主编,北大医学出版社,第三版)第 739 页全球化学品统一分类和标签制度(GHS)WHO/GHS·2005 中急性毒性危害类别和急 性毒性估计(ATE)值(表 3) 认为久效磷为第一类毒物。参照 742 页急性毒性标签要素 , (表 4) ,可得久效磷的标签为: 符号:骷髅和交叉骨;信号词:危险;危害说明:吞咽致命, 皮肤接触致命,吸入致命。 小结 利用简化寇氏法进行工业品久效磷的急性毒性实验,其实验过程比霍恩氏法稍微复杂, 且消耗实验动物较多, 但其实验结果通过统计学方法计算获得, 结果准确度和可信度比较高 , 而且可以看到剂量效应关系。 总结 根据观察小鼠灌胃后出现的腺体分泌增加、大小便增加、肌肉痉挛、抽搐等中毒症状, 推断久效磷可能作用于神经系统。经口毒性特点是接触后毒作用产生迅速, 24 小时内便呈 现明显的中毒表现。 由于本次霍恩氏法中未得到 LD50 值,因此无法将两种方法所得结果进行对照,但根据以 往资料显示,两种试验方法在规范操作下所得结果十分接近。而根据简化寇氏法结果,参照 《毒理学教程》 (周宗灿主编,北大医学出版社,第三版)第 739 页全球化学品统一分类和 标签制度(GHS)WHO/GHS·2005 中急性毒性危害类别和急性毒性估计(ATE)值(表 3), 认为久效磷为第一类毒物。 参照 742 页急性毒性标签要素 (表 4) 可得久效磷的标签为: 符 , 号:骷髅和交叉骨;信号词:危险;危害说明:吞咽致命,皮肤接触致命,吸入致命。 第二部分 40% 工业品(40%)久效磷的遗传毒性试验 工业品(40%)久效磷的遗传毒性试验 本部分实验主要包括小鼠骨髓多染红细胞微核试验和单细胞凝胶电泳试验两个遗传毒理 学试验,并由此对工业品(40%)久效磷的遗传毒性进行评价。 ? 小鼠骨髓多染红细胞微核试验 微核(Micronucleus)是由细胞分裂末期滞留的染色体断片或整条迟滞的染色体在分裂 间期的子代细胞胞浆内形成的游离团块物质。微核试验作为细胞遗传损伤的指标之一,可用 于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。 当骨髓成红细胞发展为红细胞时,主核排出,成 为多染红细胞(polychromatic erythrocyte,PCE),这些细胞保持其嗜碱性约24小时,然 后成为正染红细胞(normochromatic erythrocyte,NCE), 并进入外周血中,在主核排出时 , 已形成的微核可留在胞浆中。因为在这些细胞中没有主核,便于观察微核。观察并计数多染 红细胞中的微核, 可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。 本次试验的检测终点为染色体损伤 。 一、实验动物:健康的成年 ICR 小鼠,体重 20~30g,由北京大学医学部毒理学系实验室于 实验前准备。自由摄食饮水。 二、试剂与器材:工业品(40%)久效磷,环磷酰胺,pH 为 6.8 的小牛血清,甲醇,pH 为 6.8 的磷酸缓冲液,Giemsa 染液。一次性注射器(1.0ml) 、小鼠灌胃针头、动物称、滤 纸、剪刀、镊子、0.25ml 注射器、5 号针头、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用 4 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 染色缸、显微镜等。 三、实验方法 1.实验动物的分组:采用配伍组设计法,分组结果详见表 1-2-1.1。 2.剂量分组:设置阳性对照组、阴性对照组、高中低剂量组,阳性对照物采用环磷酰胺 (80mg/kg,8mg/ml) 阴性对照组用双蒸水。高、中、低剂量组剂量分别为 40%久效磷 LD50 , 的 1/2、1/4、1/8,即 4.32、2.16、1.08mg/kg 体重,详细见表 1-2-1.1。 3.染毒途径:经口灌胃途径染毒。 4.染毒次数及骨髓采样时间:一次染毒,24 小时后取样测定。 表 1-2-1.1 小鼠骨髓多染红细胞微核试验剂量分组 组别 阴性对照 低剂量 中剂量 高剂量 阳性对照 所给药物 双蒸水 40%久效磷 40%久效磷 40%久效磷 环磷酰胺 剂量(mg/kg体重) 1.08 2.16 4.32 80 小鼠体重(g) 21.8,23.1,23.5,24.0,24.5 22.2,23.0,23.6,24.3,24.6 22.0,23.5,23.7,24.3,25.4 21.8,23.2,23.7,24.0,25.0 21.7,23.1,23.8,24.0,25.0 四、试验步骤 1.取材:按照上表染毒24小时后,颈椎脱臼处死动物,仔细剥离并立即取下一侧后肢股骨。 用纱布擦净碎肉, 剪去股骨两端, 露出骨髓腔, 用1ml的注射器吸取少量小牛血清 (约0.02ml) 冲洗骨髓腔数次,冲洗物滴在玻片上。 2.制片:蘸取骨髓液,推片若干张,干燥后甲醇固定2分钟。 3.染色:用1:10的Giemsa-磷酸缓冲液(pH6.8)染色约25分钟,自来水冲洗后,自然干燥。 4.镜检:每只小鼠选择一张染色最成功的片子,低倍镜下观察染色及细胞分散情况,再在油 镜下计数200个红细胞,计算多染红细胞在总红细胞(PCE+NCE)中的比例,作为对细胞毒性 的指标。每例样本计数1000个多染红细胞,记录有微核的细胞数。 五、结果及分析 实验结果见表 1-2-1.2。 表 1-2-1.2 小鼠骨髓多染红细胞微核试验结果 组别 小鼠编号 PCE/NCE 微核细胞率‰ 微核率‰ 1 7 9 13 29 4 6 26 38 34 3 14 16 107:93 116:84 124:76 122:78 117:83 120:80 116:84 128:72 118:82 117:83 1.8 1.7 130:70 1 0 4 2 0 11 7 8 6 13 1 1 4 1 0 2 2 0 13 9 11 8 13 1 1 4 阴性对照组 低剂量组 中剂量组 5 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 19 27 15 17 18 24 25 5 8 12 23 2 130:70 113:87 151:49 106:94 55:145 72:128 84:116 142:58 124:76 81:119 86:114 132:68 4 4 7 3 4 52 16 72 57 66 62 48 4 4 12 4 4 96 34 80 73 78 71 56 高剂量组 阳性对照组 理论上PCE/NCE的数值在0.1-2.0之间,但当发生骨髓抑制时,外周血 会返流,导致比值偏小,此时应停止试验操作。本试验中未出现小于0.1的情况,除 5 号小鼠和 8 号小鼠出现比值大于 2.0 以外其余小鼠 PCE/NCE 比值均在理论值范围内,其原 因有可能是实验误差或小鼠体质差异等。从结果看本次试验小鼠未出现骨髓抑制问题。 利用 SPSW 对微核细胞率进行显著性检验,检验各组微核细胞率比阴性对照组是否有 显著性增加,得到结果如表 1-2-1.3。 表1-2-1.3微核细胞率显著性检验结果 成对差分 均值的标 均值 阴性对照组 - 低剂量组 阴性对照组 - 中剂量组 阴性对照组 - 高剂量组 阴性对照组 - 阳性对照组 -7.60000 -1.40000 -15.00000 -59.60000 标准差 3.91152 1.67332 20.46949 8.32466 准误 1.74929 .74833 9.15423 3.72290 差分的 95% 置信区间 下限 -12.45680 -3.47770 -40.41623 -69.93643 上限 -2.74320 .67770 10.41623 t -4.345 -1.871 -1.639 df Sig. (双 侧) 4 .012 4 .135 4 .177 4 .000 -49.26357 -16.009 根据表1-2-1.3结果,低剂量组以及阳性对照组对于阴性对照组其微核细胞率有显著性增 加,而中剂量组和高剂量组对于阴性对照组其微核细胞率没有显著性的增加。低剂量组的工 业品(40%)久效磷相比阴性对照组表现出显著遗传毒性而中剂量组和高剂量组相对于阴性 对照组却没表现出显著的遗传毒性。 利用SPSW对微核细胞率和灌胃剂量进行一元线,说 , 明灌胃剂量和微核细胞率没有表现出明显的线性相关。 小结 本实验通过对微核细胞率的分析来评价受试物的遗传毒性。从本次试验所得结果上看, 中剂量组和高剂量组相对于阴性对照组没表现出显著的遗传毒性效应, 而低剂量组相对于阴 性对照组表现出了显著地遗传毒性。并且高剂量组中 24 号小鼠微核细胞率明显比同组的其 他小鼠高,本组数据的标准差达 20.5。出现这样的结果从实验操作操作方面原因来看可能是 实验人员实验室操作不够规范,在灌胃、取骨髓、纸片过程中出现各人的不同偏差,或者在 镜检的时候各实验员对微核细胞的辨认、计数等不够规范所致。 6 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 ? 单细胞凝胶电泳实验 SCGE 又称为彗星试验( comet assay) ,是一个检测 DNA 断裂的基本方法。细胞核中, DNA 是环状附着在核基质上,细胞裂解过程中,核基质被溶解、抽提,DNA 的结构则未发 生变化。如果 DNA 链上存在缺口,则使 DNA 超螺旋变得松弛,DNA 环向外展,同时由于 暴露了阴电荷,在电场力的作用下,松动的 DNA 环向阳极迁移,但由于这种松动的 DNA 环一端仍附着于核 DNA,其迁移距离受到限制,因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少。 实际应当依靠尾长与尾部的荧光强度同时来进行分析。 一、试剂与器材: 1.试验细胞来源:成年健康的雄性 ICR 小鼠的肝、脾、睾丸、胸腺。 2.试剂:①40%工业品久效磷 ② 无钙 、 镁 磷 酸 盐 缓 冲 液 : NaCl 4.0g 、 KH2PO4 0.1g 、 KCl 0.1g、 Na2HPO4 0.58g 、 Na2HPO4·12H2O 1.45g 溶于 500ml 双蒸水中 ③琼脂糖:用无钙、镁磷酸盐缓冲液配制 ④细胞裂解液: NaCl 2.5M 73.05g、Na2EDTA·2H2O 100mM 18.6g、Tris 10mM 0.61g、肌 氨酸钠 1% 5g、双蒸水 400ml,先加入一些 NaOH 在磁力搅拌器上加热溶解。用 NaOH 调 整 PH 值到 10.0。加水定容至 500ml。 临用前加入 Triton X-100 至终浓度为 1% ⑤电泳缓冲液:Na2EDTA·2H2O 1mM 0.372g、NaOH 300mM 12g、双蒸水 1000ml,临用 时配制 ⑥中和液(0.4M Tris-HCl):Tris 24.22g、双蒸水 300ml、pH 为 7.5 的浓 HCl ,加双蒸水至 500ml ⑦碘化丙啶(PI)5μg/ml,先配成储备液,然后稀释,用蒸馏水配制,4℃保存 3. 仪器:电泳仪、电泳槽、荧光显微镜、恒温水浴、剪刀、镊子、一次性注射器(1.0ml)、 吸量管(1ml、2ml、5ml) 、容量瓶( 25ml、50ml) 、烧 杯 (10ml、50ml) 、吸管、小鼠灌胃 针头、动物称、洗耳球、滤纸。 二、实验方法 1.实验动物的分组:分组结果详见表 1-2-2.1。 2.实验动物处理:阳性对照组用 K2Cr2O7,浓度 2mmol/L,高、中、低剂量组剂量分别为 40%久效磷 LD50 的 1/2、1/4、1/8,即 4.32、2.16、1.08mg/kg 体重,阴性对照组只给水。 根据表 1-2-2 对实验动物进行灌胃染毒。 表 1-2-2 单细胞凝胶电泳实验小鼠编号、体重、剂量分组 组别 小鼠编号 体重(g) 受试物 灌胃剂量(mg/kg) 阳性对照组 高剂量组 中剂量组 低剂量组 阴性对照组 1 2 3 4 31.6 34.1 30.7 34.3 K2 CrO7 40%工业久效磷 40%工业久效磷 40%工业久效磷 双蒸水 4.32 2.16 1.08 3. 胶板制备:每组 4 张胶板,分别用于肝、脾、睾丸及胸腺的电泳。 ①取大约 35μl 于 56℃水浴中保温的 0.5%普通熔点琼脂糖,铺于磨砂载玻片上形成底胶。 (为了增加胶板层与载玻片的粘性) ②取大约 150μl0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上, 再于其上加盖玻片, 4℃冷凝 10 分 钟 (普 。 通熔点琼脂糖比低熔点便宜得多) ③处死动物:染毒后 1 小时颈椎脱臼处死小鼠。分别取 1cm2 肝、脾、一侧睾丸、一侧胸腺 , 7 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 置于盛有 Hanks’液的小平皿中,在筛网中研磨,制备成单细胞悬液。 ④取下盖片,取50μl 于 37℃水浴中保温的 1.0%的低熔点琼脂糖与 50μl 细胞悬液(105 个 细胞/ml)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4℃冷凝 10 分钟。 ⑤去掉盖玻片,取 70μl 于 37℃水浴中保温的 0.5%的低熔点琼脂糖铺片,加盖玻片,4℃冷 凝。 4. 细胞裂解与电泳 ① 将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于 4℃预冷的细胞裂解液中,4℃裂解 1 小时。 ② 取出胶板,放入电泳槽中,浸泡在电泳液中解旋 20 分钟。 ③ 4℃电泳 20 分钟(25V,300mA) 5. 中和与染色 ① 电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次 15 分钟,共中和两次,之间更换中和液。 ② 取出胶板,置于染色架上,滴加 5μg/ml 的 PI,暗处染色 20 分钟。 ③ 蒸馏水脱色 15 分钟。 6. 镜检 在荧光显微镜下观察,绿光激发吸收滤片 590nm。照相记录。 三、结果和分析 镜检结果如下图所示。 8 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 上图中缺失部分为实验小组的载玻片在镜检前损坏,未能进行镜检,导致数据的缺失。 由于试验条件和课堂时间的限制,对于本次实验结果的未进行定性分析,仅从对比观察各组 所得的镜检照片获得对彗星试验结果的一定的定性认识。从各组照片上看,各组的细胞均有 出现彗星拖尾的现象。而阴性对照中胸腺细胞中也出现了明显的彗星细胞,相比之下,阳性 对照组有数个涂片中未出现明显的彗星细胞。 本次实验中亦未观察到各剂量组间的明显剂量 效应关系。本次实验的实验结果可靠性差,并不可用。 小结 本次实验出现实验数据不可用的结果可能是因为试验过程中阴性对照组和阳性对照组 出现了一定的试剂污染(此两组用的是同一只老鼠的脏器)或者各组实验员在其他的操作上 的失误,包括灌胃、制片等操作失误都可是最终的实验结果出现偏差。另外镜检不够仔细, 照片选取视野不佳都可能影响本次实验结果。 Ames 二、Ames 试验 利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的突变型即组氨酸缺陷型(his-) , 作为指示生物。这些菌株在无组氨酸的培养基上不能生长,在有组氨酸的培养基上可以正常 生长。致突变物可使沙门氏菌突变为野生型(his+),恢复了合成组氨酸能力,因而在无组 氨酸培养基上也能生长为可见菌落。故可根据在无组氨酸培养基菌落生成数量,检查受试物 是否为致突变物。对于间接致突变物,可用经Aroclor1254(或多氯联苯)诱导的大鼠肝匀 浆制备的S9混合液作为代谢活化系统。 正向突变 鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+) 组氨酸营养缺陷型突变株(his-) 回复突变 ±S9代谢活化系统 受试物 一、试剂和器材 1. 器材 37℃孵箱、恒温水浴、紫外线灯、酒精灯、接种针、灭菌试管和试管架、灭菌吸管(10ml 和 2ml) 、微量取样器及灭菌吸液尖。 9 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 2. 培养基和试剂 四种试验菌株的肉汤培养物、最低葡萄糖平皿、肉汤平皿、顶层琼脂、 0.5mmol/L 组氨 酸/0.5mmol/L 生物素、0.1mol/L 组氨酸/0.5mmol/L 生物素、0.1%结晶紫水溶液、氨苄青霉素 1mg/ml(0.02mol/L NaOH) 、四环素 0.08mg/ml(0.02mol/L NHCl)、叠氮钠 10mg/ml(灭菌水) 。 二、菌株 TA97、TA98、TA100、TA102 三、实验项目 限于实验室条件条件,本次实验内容主要为试验菌株的鉴定和叠氮钠对 TA100 菌株直接致 突变性的证实。 (一) 四种试验菌株的鉴定 1. 基因型鉴定:组氨酸需求试验、结晶紫敏感试验、紫外线敏感试验、氨苄青霉素抗性 (R 因子)试验和四环素抗性(pAQ1 质粒)试验。 2. 四种试验菌株自发回变数测定。 3. 四种试验菌株对鉴别性致突变物 40%工业品久效磷及叠氮钠的反应。用点试验法,均 不加入 S9 混合液,滤纸片上分别滴加久效磷和叠氮钠水溶液(10mg 溶于 1ml 水中)10μl。 (二) 叠氮钠对 TA100 菌株直接致突变性的证实试验 1. 用 TA100 菌株的肉汤培养物,不加 S9 混合液,每皿叠氮钠剂量分别为 1、2、4、8μg, 以观察叠氮钠对 TA100 菌株直接致突变性的剂量-反应关系。 2. 所有的试验平皿翻转后,置于 37℃孵箱内培养 48 小时,观察结果。 四、结果和分析 1.菌株鉴定:见表 2-1.1。 表 2-1 菌株鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102 基因型鉴定 His 需求 Rfa 突变 修复缺陷 R 因子 pAQ1 质粒 自发回变菌落 ① ② ③ X±SD TA100 对鉴别性 致突变物的反应 40%久效磷 + + + 41 32 污染 36.5±7.8 + + + + 29 14 29 24±12.2 + + + + 135 154 124 138±15.2 + + + + 0 0 0 0 2mg/皿(-) 直 1mg/皿(-) 直 , , 径 4cm 抑菌环 径 3cm 抑菌环 叠氮钠 0.2μg/皿( +)污 0.1μg/皿(+) 染 对比菌株鉴定标准,如表 2-1.2,根据本次试验的菌株鉴定结果,本次试验所用菌株除了 TA100 其余是不符合标准的。从表 2-1.1 中也可以看出 40%久效磷具有抑菌作用而不具有致 突变作用,而叠氮钠具有一定的致突变作用。 8mg/皿(-) 抑 , 菌环 0.8μg/皿(+) 4mg/皿(-) 直 , 径 6cm 抑菌环 0.4μg/皿(+) 10 预防医学 2006 级 1 班 余治平 90606126 表 2-1.2 2. 叠氮钠对 TA100 菌株致突变性的证实:见表 2-1.3。 叠氮钠剂量 (μg/皿) 1 2 4 8 回变菌落数 ① 316 570 877 1050 ② 307 496 823 1153 X±SD 311.5±6.3 533±52.3 850±38.2 1101.5±72.8 判定叠氮钠对 TA100 菌株有致突变性可通过明显的剂量 -效应关系或者有一个浓度的回 变数超过自发回变数 2 倍。利用 SPSW 软件对叠氮钠剂量(μg/皿)和回变菌落数作一元线 菌株致突变作用有明显的剂量-效应关系。另 外表 2-1.3 中每个浓度的叠氮钠对应的回变菌落数均大于自发回变数的 2 倍。故可以证实叠 氮钠对 TA100 菌株有致突变性。 小结 本次实验要求严格的无菌操作,实验结果中出现的几个被污染的平皿可能就是因为操作 不规范引起的污染导致皿中真菌等滋生。在菌株鉴定中,除了 TA100 菌株外其余菌株的自 发回变数均没达到标准,另外 TA120 未表现出抗四环素的特性。出现这样的结果可能是由 于实验员操作不够规范,细菌在种植的时候已被烫死或者其他操作失误所致。 11

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